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紫外近红应用-DNA检测
发布时间:2014-08-20   点击次数:1313次

实验一  DNA检测

目的:

检测DNA   

原理:

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280nm波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系,故可作为蛋白质定量测定的依据,但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同,故要准确定量,必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较,或且已经知道其消光系数作为参考。

不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力,可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的zui大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时,必须同时测定OD260nm,与OD280nm。,然后根据两种波长的吸收度的比值,通过经验公式校正,以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

实验方法:

采用紫外可见近红外分光光度计中浓度扫描方式,按照图表配置标准蛋白质,绘制标准曲线

 

波长:280nm  直接从标准曲线读取被测液体的光密度值

以标准管各管光密度值为纵坐标,以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线,然后根据测定管光密度值,直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。

计算方法一 

选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品,用生理盐水稀释至浓度为 lmg/m1,作为稀释标准蛋白质溶液。

用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg/m1,即为稀释样本蛋白质溶液。

紫外近红测试方法:

  • 基线设置波长范围250-290nm
  • 选择浓度扫描,

 

计算方法二

利用经验公式直接计算

准确吸取血清样本0.1ml,置于50ml容量瓶中,用生理盐水稀释至刻度,即500倍稀释,在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。
1、OD280/0D260<1.5时,用Lowry-Kalokar公式:
样本蛋白质含量(mg/m1)=1.45OD280一0.74OD260 
2、OD280/OD260﹥1.5时,用Lamber-Beer定律计算:
样本蛋白质含量(mg/m1) = OD280/K×L=(OD280/6.3×1)×10g/L
本实验样品:牛血清白蛋白E1%cm=6.3(100ml/cm.g)
           K:克分子消光系数;E1%cm:百分比吸光度的吸光系数;
注:不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异,故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似,以减小误差。

 

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